數(shù)字分光光度計原理是我們從事實驗室儀器研究和應用的人員需要掌握的知識。分光光度計就是利用分光光度法對物質(zhì)進行定量定性分析的儀器。該儀器是實驗室、科研機構(gòu)、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品廠、飲用水廠等機構(gòu)*檢驗設備。已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。
數(shù)字分光光度計常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。分光光度計基本原理是指采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比。
數(shù)字分光光度計詳細情況如下：
組成部分一：電光系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中主要是由鎢燈和相應的電源組成，這種系統(tǒng)對整體的穩(wěn)定性就有很大影響，當該系統(tǒng)不能正常工作后也會導致儀器工作不穩(wěn)定。
組成部分二：光學系統(tǒng)。這種系統(tǒng)包括有外光路系統(tǒng)和單色器2個主要部分，其中外光路和單色器都有很多類型，單色器就是紫外可見分光光度計散光的主要來源。
組成部分三：光電系統(tǒng)。該系統(tǒng)是紫外可見分光光度計zui關鍵的部件，系統(tǒng)會直接影響到儀器中的靈敏度和適用范圍，里面有光電倍增管、光電管、二極陣列和硅光電池等。
組成部分四：電子系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中主要有放大器和A/D變換器等組成，其中放大器就是影響整機靈敏度和穩(wěn)定性的主要相關部件。
組成部分五：輸出打印系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。該系統(tǒng)是決定整機自動化程度的關鍵部件，能夠直接影響紫外可見分光光度計的質(zhì)量。
物質(zhì)對光的選擇性吸收波長，以及相應的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū)，除某些物質(zhì)對光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時應用標準品或?qū)φ掌吠瑫r操作。
數(shù)字分光光度計原理說明的這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm的“背景”信息，設定此功能“開”。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，*的線性范圍在1.0-1.5之間。實驗中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個正常的現(xiàn)象。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因為Warburg公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
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